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剛開始能夠選擇的角色只有一個(Isaac)，隨著遊戲的推進，會逐漸解鎖其他角色。
| 角色名稱 | 生命值 | 速度 | 射速 | 傷害 | 射程 | 初始道具 | 備註 | 人物介紹 |
| 以撒 (Isaac) |
3 | 2 | 2 | 2 | 2 | 炸彈x1。 骰子(The Dice) (使用???通關The Womb後才會攜帶)。 |
默認角色。 基礎移動速度100%。 |
亞伯拉罕之子，在遊戲開始的劇情中，被要求獻祭給上帝。 |
| 抹大拉 (Magdalene) |
4 | 1 | 2 | 2 | 2 | 美味的心(Yum Heart)。 | 在一次遊戲中將生命值上限提升到7個心之容器(不計算魂心)解鎖。 基礎移動速度85%。 |
耶穌在俗世間最親密的信仰伴侶，也被稱作瑪麗(Mary)。 |
| 該隱 (Cain) |
2 | 3 | 2 | 3 | 1 | 鑰匙x1。 幸運腳(Lucky Foot)。 |
在一次遊戲中持有55金錢解鎖(不計算已經花掉的)。 基礎移動速度100%，左眼被眼罩罩住，只有右眼發射子彈。 |
亞當和夏娃的兒子，亞伯(Abel)的哥哥，後來殺死了亞伯。 |
| 猶大 (Judas) |
1 | 2 | 2 | 4 | 2 | 硬幣x3。 惡魔之書(The Book Of Belial)。 |
第一次擊敗Mom’s Heart解鎖。 基礎移動速度100%。 |
猶大·伊斯卡洛特(Judas Iscariot)，因背叛耶穌而廣為人知。 |
| 夏娃 (Eve) |
2 | 3 | 2 | 1 | 2 | 死亡之鳥(Dead Bird)。 巴比倫娼婦 (Whore Of Babylon)。 |
在一次遊戲中在惡魔房間裡消費兩次解鎖，即使消費導致角色死亡。 基礎移動速度123%。 |
上帝創造的第一位女性。 |
| ??? | -1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 魂心x3。 便便(The Poop)。 |
在擊敗It Lives（END 10）後解鎖。 永遠無法獲得心之容器。通常提升心之容器數量的道具，只會增加一顆魂心；也可直接拾取魂心。 基礎移動速度110%。 |
在以撒的空玩具箱（金箱子）內因缺氧逝去的以撒。 |
| 《羔羊的憤怒》資料片新增加的人物 | ||||||||
| 參孫 Samson |
1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 魂心x1。 嗜血(Bloody Lust)。 |
解鎖方式：擊敗Mom，並在遊戲過程中跳過兩間藏寶室。 基礎移動速度110%。 子彈飛行速度131%。 |
他因上帝的旨意而降生人間，去擊敗非利士人(the Philistines)，卻因沉迷女色而被剪掉了頭髮(他的三個力量來源之一，其餘兩個是禁酒和不近女色)。在失去力量後變為盲人。 |